Quais os cuidados que devemos ter na preparação dos meios de cultura?

Podemos ver uma árvore apodrecendo ou sentir o cheiro do leite azedando, mas podemos não compreender o que está ocorrendo a nível microscópico. Em ambos os casos, os microrganismos estão agindo. A árvore apodrece quando os microrganismos decompõe a madeira, o leite azeda devido à produção de ácido lático pelas bactérias. Assim, como todos os organismos, os microrganismos usam nutrientes para o crescimento e para todas as outras funções essenciais à vida.

Quando falamos em crescimento, estamos nos referindo ao número e não ao tamanho das células. Os microrganismos em crescimento estão, na verdade, aumentando seu número e se acumulando em colônias. Por meio do entendimento das condições necessárias, podemos estimular e controlar o crescimento dos que estamos interessados em analisar, como microrganismos patogênicos ou que contaminam água e degradam alimentos.

Aqui entram os meios de cultura que fornecem as condições ideais para que isso ocorra.

O que são Meios de Cultura?

Os meios de cultura são insumos preparados em laboratórios que fornecem os nutrientes para o crescimento e desenvolvimento de microrganismos (como bactérias, fungos e leveduras) fora do seu habitat natural. Existe uma variedade enorme destes meios e são utilizados para análises laboratoriais e estudos científicos em diversas áreas, principalmente em pesquisas de alimentos, água, cosméticos e microbiologia clínica.

Além dos nutrientes e condições ambientais favoráveis para esse cultivo, muitos critérios devem ser considerados. Diferentes microrganismos possuem diferentes necessidades, por isso o meio de cultura é adaptado para satisfazer essas necessidades, utilizando nutrientes específicos dependendo do microrganismo de interesse.

>> Leia também – Meios de Cultura: Como diferenciar meio enriquecido, seletivo e diferencial.

Cultivo de Microrganismos

Para entender como todo esse processo ocorre em um ambiente controlado, vamos verificar as ferramentas e etapas envolvidas:

• Meio de cultura – base que oferece nutrientes, favorecendo o crescimento de determinado microrganismo.

• Inóculo – quando os microrganismos de interesse são colocados em um meio de cultura para iniciar o crescimento.

• Cultura – quando microrganismos crescem e se multiplicam no meio.

• Placa de Petri – recipiente estéril, constituído por uma base e tampa, ideal para crescimento da amostra em condições controladas.

• Ágar – substância em gel colocada na placa de Petri que suporta e propicia o crescimento dos microrganismos.

O Ágar Bacteriológico é um ágar purificado no qual impurezas, pigmentos e sais foram removidos ou reduzidos ao mínimo. É um extrato hidrossolúvel extraído de algas vermelhas e pode ser utilizado como agente solidificante em meio de cultura bacteriológico ou para determinar motilidade e crescimento de anaeróbios e microaerófilos.

• Alças de Inoculação – utilizada para inocular a amostra, sem danificar o meio de cultura.

Primeiro é preparado o ágar (muitos deles já contém os nutrientes necessários para a cultura) que em seguida é despejado na placa de Petri, formando uma camada no fundo. Depois que a solução endurece, o microrganismo pode ser inoculado, geralmente através de uma alça de inoculação. Nesta etapa alguns cuidados devem ser tomados para que não haja nenhuma contaminação e só o microrganismo de interesse esteja presente. As placas de Petri devem ser incubadas e armazenadas em posição invertida de forma que o ágar fique para cima, assim a condensação não cairá sobre a amostra interrompendo a superfície de crescimento.

Confira o vídeo com o protocolo comumente utilizado para o crescimento dos microrganismos em laboratório, que compreende o desenvolvimento de uma colônia a partir de uma ou algumas células para posterior estudo ou análise.

Com informações do livro “Microbiologia” TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Artmed. 8ª edição.

Milhares de microrganismos vivem no interior e ao redor de nossos corpos e, muitos deles, podem ocasionar doenças graves. Para estudar os microrganismos foram desenvolvidas diversas técnicas para isolar e identificar o agente em laboratório.

A microbiologia clínica tem um papel importante no diagnóstico e controle de doenças infecciosas. Porém a qualidade da análise está diretamente relacionada a qualidade de espécime coletado do paciente, a maneira como é transportado e as técnicas para detecção do microrganismo na amostra.

A maioria dos testes baseia-se na capacidade de crescimento do microrganismo. Assim, as condições de coleta e transporte são fundamentais para garantir a viabilidade do patógeno. Mas o que é necessário para cultivar microrganismos em laboratório?

Meios de Cultura

Diferentes microrganismos têm diferentes exigências para o seu crescimento. Para que seja possível realizar a cultura e análise em laboratório é necessário conhecer quais as necessidades nutritivas e condições físicas para cada um.

O material nutriente preparado para o crescimento de microrganismos é chamado de meio de cultura. Pelo fato de a cultura em laboratório ser requerida para o estudo detalhado de qualquer microrganismo, é necessária atenção criteriosa na seleção e no preparo dos meios para que o cultivo seja bem-sucedido.

Deve-se verificar também a quantidade de água suficiente, pH adequado e a presença ou não de oxigênio.

Cultivo de microrganismos em laboratório

Para a identificação do patógeno é necessário que uma amostra seja obtida do lugar da infecção. A amostra deve ser coletada com cuidado evitando contaminação com outros organismos.

Depois o meio de cultura com os nutrientes necessários é preparado e esterilizado. Assim, garante-se que não há nenhuma outra forma de vida ou contaminação no meio. O patógeno é então inoculado.

A cultura é incubada em condições que permitem o crescimento. Normalmente a inoculação será de uma cultura pura em um meio líquido ou sólido.

Como os microrganismos se desenvolvem em um Meio de Cultura?

Principais meios de cultura utilizados e suas aplicações

Meio Stuart

Princípio

A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles.

Utilidade

• Transporte de diversos materiais e consequente conservação dos microrganismos.
• Conservação de microrganismos patogênicos como: Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.

 Agar Nutriente

Princípio

O Nutriente ágar é um meio relativamente simples, de fácil preparação e muito usado nos procedimentos do laboratório de microbiologia.

Utilidade

• Ágar nutriente tem várias aplicações no laboratório de microbiologia, e pode ser utilizado para análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas a exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras.
• O uso mais frequente é para a conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente neste ágar, como método opcional para os laboratórios que não dispõem do método da crioconservação (congelamento das cepas em freezer à – 70ºC).
• Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos.

Agar CLED – Cystine Lactose Electrolyte Deficient

 Princípio

Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus.

Utilidade

• Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras.

Agar Mueller Hinton

Princípio

Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de crescimento das principais bactérias.

Utilidade

• Meio utilizado para a realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos métodos de difusão em disco e e-test para enterobactérias, não fermentadores, Staphylococcus, Enterococcus sp.

Agar Mueller Hinton – Você conhece seu uso e aplicação?

Agar MacConkey

Princípio

O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos.

A concentração de sais de bile é relativamente baixa em comparação com outros meios, por isso não é tão seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS.

Utilidade

• Isolar bacilos Gram negativos (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a fermentação ou não da lactose.

Agar Salmonella Shigella (SS)

Princípio

Ágar SS possui componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem microrganismos Gram positivos.

A incorporação de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo é lactose positiva (bactérias que fermentam a lactose produzem ácido que na presença do indicador vermelho neutro resultando na formação de colônias de cor rosa) e bactérias que não fermentam a lactose formam colônias transparentes.

O tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro.

Utilidade

• Selecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e água.

Agar Sabouraud Dextrose

Princípio

Meio com nutrientes que favorece o crescimento de diversos fungos leveduriformes e filamentosos.

Utilidade

• Cultivo e crescimento de espécies de Candidas e fungos filamentosos, particularmente associados a infecções superficiais.
• Caracterização macroscópica do fungo filamentoso (colônia gigante).

Agar Sal Manitol

Princípio

O meio consiste na caseína digerida e tecido animal, extrato de carne, manitol, sais e vermelho de fenol. Os estafilococos podem crescer na presença de elevadas concentrações de sal e o S. aureus pode fermentar o manitol produzindo colônias de cor amarela.

Utilidade

• Meio seletivo utilizado para o isolamento de estafilococos.

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Referências:

• ANVISA 1
• ANVISA 2 
• MADIGAN, Michael T. et al. Microbiologia de Brock. 14. ed. Porto Alegre: ArtMed, 2016.
• PRADO, Felício Cintra; RAMOS, Jairo de Almeida; VALLE, José Ribamar. Atualização terapêutica: manual prático de diagnóstico e tratamento. 10. ed. São Paulo: Artes Médicas, 2005.
• BROOKS, Geo. F. et al. Microbiologia médica de Jawetz, Melnick e Adelberg. 26. ed. Porto Alegre: AMGH, 2014.
• TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 10. ed., Porto Alegre: Artmed, 2010.
• MURRAY, Patrick; ROSENTHAL, Ken; PFALLER, Michael. Microbiologia Médica. 7.ed. Rio de Janeiro: Elsevier Brasil, 2015.

Quais os principais cuidados na preparação de um meio de cultura?

Como um meio de cultura deve ser preparado?

Quais as condições para um meio de cultura adequado?

Quais os cuidados que se deve tomar em laboratórios de microbiologia?